Latar Belakang: Aspergillosis adalah penyakit infeksi jamur yang disebabkan oleh genus Aspergillus. Terdapat sekitar 200 spesies Aspergillus yang diketahui, tetapi hanya 40 spesies bersifat patogen terhadap manusia dengan patogen tersering berupa A.fumigatus, A.flavus, dan A,niger. Gejala aspergilosis bervariasi dari manusia ke manusia berdasarkan sistem imun tubuh yang dibagi menjadi hipersensitif, imunokompeten dan imunokompromi. Infeksi paling berbahaya terlihat pada pasien imunokompromi, terutama pasien dengan komorbid yaitu aspergilosis invasif pulmoner (AIP), penyakit terberat dari semua gejala. Kesulitan AIP datang dari gejala non-spesifik yang timbul pada pasien sehingga terjadi misdiagnosis atau tidak terdiagnosis, mengakibatkan pasien terlambat mendapatkan pertolongan dan peningkatan tingkat mortalitas. Oleh karena itu, diperlukan metode yang cepat dan akurat dalam mendiagnosis pasien AIP. Penelitian ini bertujuan untuk 3 spesies jamur Aspergillus patogen (A.fumigatus, A.flavus, dan A.niger) menggunakan inner primer yang didesain in house pada daerah Internal Transcribed Spacer (ITS) dan PCR konvensional dengan modifikasi primer dari Skladny et al (1999) pada daerah 18S ribosomal DNA (rDNA)
Metode: Uji nested PCR dibagi menjadi 2 tahap menggunakan Primer ITS1/4 pada tahap 1 dan inner primer yang dirancang sendiri pada tahap 2. Pasangan Inner primer dibuat dari daerah konservatif sekuens Aspergillus fumigatus, A.flavus, dan A.niger strain Indonesia menggunakan MAFFT alignment software. Spesifisitas primer diuji secara in silico melalui NCBI-BLAST dan divalidasikan melalui visualisasi amplikon via elektforesis gel agarosa terhadap beberapa patogen infeksi saluran pernapasan. Visualisasi amplion dengan elektroforesis gel agarosa memakai ekstrak DNA sampel A.fumigatus, A. flavus, A. niger, Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Histoplasma capsulatum, Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae, serta Haemophilus influenza.
PCR konvensional menggunakan modifikasi dari primer AFU7S/AF7AS dari Skladny et al (1999). Ditentukan posisi primer pada hasil sekuensing ketiga sekuens Aspergillus strain Indonesia menggunakan MAFFT alignment software. Primer diuji menggunakan PCR primer stats dan dimodifikasi sampai memenuhi kriteria primer ideal. Primer divalidasi secara in silico menggunakan NCBI-BLAST dan wet lab via elektroforesis gel agarose. Pengerjaan wet lab menggunakan ekstrak DNA sampel A.fumigatus, A. flavus, A. niger, Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Histoplasma capsulatum, Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae, serta Haemophilus influenza.
Hasil: Inner primer ITS AF1F/R menghasilkan beberapa amplikon dari 200 hingga 500 bp pada ketiga spesies Aspergillus. Primer AFIF/R juga mengamplifikasi sampel H.capsulatum pulmoner 1 pada 200 – 300 bp, sesuai target amplikon primer untuk sampel Aspergillus. Modifikasi primer AF2F/AFU7AS menghasilkan pita tunggal pada 400 bp untuk ketiga sampel Aspergillus.
Kesimpulan: Inner Primer ITS AF1F/R kurang ideal dalam mendeteksi Aspergillus karena timbul pita tambahan dan hasil positif palsu pada sampel H.capsulatum pulmoner 1 sedangkan Modifikasi primer AF2F/AFU7AS dengan gen target 18S rDNA menjadi sebuah langkah awal dalam mendeteksi Aspergillosis di Indonesia melalui PCR. Akan tetapi, dibutukan penelitian lebih lanjut dalam menguji spesifisitas primer terhadap patogen lain. |